液相色谱法地榆中金丝桃苷的含量的测定

　　一、实验背景
 

　　1、目的：建立地榆中金丝桃苷的液相色谱含量测定方法。
 

　　2、方法：采用RP-HPLC测定，C18柱，流动相为甲醇-0.2%磷酸溶液(46∶54)，用三乙胺调pH至3.0，流速1.0ml·min-1，检测波长370nm；供试品溶液的制备采用甲醇超声提取。
 

　　3、结果：测定了不同产地不同批次的地榆药材，金丝桃苷质量分数在0.052%～0.291%。结论该方法灵敏快速，准确可靠，可用于地榆的质量控制。
 

　　4、意义：地榆为蔷薇科植物地榆或长叶地榆的干燥根。其味苦、酸、涩，微寒，具有凉血止血、解毒敛疮之功效。现代药理研究表明其具有显着的镇痛作用，主要有效成分为黄酮类化合物，但药典记载质量标准的定量检测方法仅为紫外-可见分光光度法测定其鞣质含量，该法操作繁琐。金丝桃苷为地榆药材中提取得到的黄酮类化合物。研究表明，地榆中的金丝桃苷是其止痛作用的有效成分之一。本实验采用RP-HPLC法对不同产地中药材市场商品地榆的金丝桃苷成分进行了定量分析，考察了流通商品地榆的质量状况，为进一步提高地榆药材的质量控制提供了科学依据。
 

　　二、仪器与试药
 

　　1、液相色谱仪，含在线脱气机、四元梯度泵、自动进样器、智能柱温箱、紫外可见光检测器(VWD)、化学工作站。超声波清洗器。
 

　　2、地榆的干燥根或饮片。实验中将样品粉碎后过100目筛，置干燥器中备用。
 

　　3、金丝桃苷(111521-200303，国药品生物制品检定所,供含量测定用)。甲醇为色谱纯，实验用水为Milli-Q超纯水。其他试剂均为分析纯。
 

　　三、方法与结果
 

　　1、对照品溶液的制备
 

　　精密称取金丝桃苷13.25mg，置量瓶中，加甲醇定容至25ml，其金丝桃苷含量为0.53mg·ml-1。再精密吸取金丝桃苷对照品溶液2.0ml，加甲醇定容至50ml量瓶中，其金丝桃苷含量为0.0212mg·ml-1。
 

　　2、供试品溶液的制备
 

　　取地榆干燥药材或饮片的粉末(过100目)1g，分别精密称定，至具塞锥形瓶中，精密加入甲醇100ml，称定重量，超声提取1h，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，用续滤液作为供试品溶液。
 

　　3、色谱条件
 

　　HypersilODS2分析柱(4.6mm×250mm，5μm)；流动相甲醇-0.2%磷酸溶液(46：54)，用三乙胺调pH至3.0；流速1.0ml·min-1；检测波长370nm；柱温25℃；进样量10μl；在选定的色谱条件下，色谱柱的分离效率(简称柱效)>理论塔板数以金丝桃苷峰计算不低于3000。分离度大于1.5，拖尾因子在0.95～1.05。
 

　　4、检测波长的选择
 

　　取金丝桃苷对照品适量，用甲醇溶解后作紫外全波长扫描，λ286，370nm,因286nm下非黄酮物质也有吸收，为避免干扰，选择检测波长为370nm。
 

　　5、线性关系的考察
 

　　分别精密吸取0.0212mg·ml-1的金丝桃苷对照品溶液2，4，6，8，10，12，16μl注入液相色谱仪，测定基线构成之面积称峰面积。A=×σ×h=2.507σh=1.064Wh/2h>峰面积，以金丝桃苷含量(X)为横坐标，其峰面积吸收度积分值(Y)为纵坐标，绘制标准曲线，其回归方程为：Y=2263.9X+2.9635，r=0.9998(n=7)，表明金丝桃苷在0.04～0.34μg线性关系良好。
 

　　6、精密度实验
 

　　精密吸取0.0212mg·ml-1金丝桃苷对照品溶液10μl，连续进样5次，测得峰面积积分值RSD为0.86%，表明精密度良好。
 

　　7、重复性实验
 

　　精密称取同一样品粉末1g(5份)，按供试品溶液的制备方法制备，进样10μl，测得金丝桃苷含量的RSD为0.99%，表明该方法的重复性好。
 

　　8、稳定性实验同一供试品溶液，从制备完毕开始放置，分别于0，2，4，6，8，10h进样检测，其峰面积积分值RSD为1.9%。表明供试品溶液在10h内比较稳定。
 

　　9、加样回收率实验
 

　　取已知含量的药材(6号含量1.60mg·g-1)样品6份，每份0.50g，精密称定，计算样品中金丝桃苷量，分别加入适量的金丝桃苷对照品，按样品制备方法和测试条件进行测定，计算加样回收率。
 

　　10、样品测定
 

　　分别精密吸取各样品10μl进样测定，计算含量。
 

　　四、实验结果讨论
 

　　1、提取条件的选择
 

　　根据金丝桃苷的溶解性能，选择乙醇、甲醇、醋酸乙酯作为提取溶剂，比较了3种提取溶剂提取方法(超声、回流及索氏提取)和不同提取时间(0.5，1.0，1.5h)对提取效果的影响。结果显示采用超声提取方法的提取率zui高，甲醇提取效果，含量结果表明超声提取1.0h可使待测成分提取*。实验证实，含量并未随着提取时间延长而有所增加，超过1h时含量甚至有下降的趋势。
 

　　2、流动相的选择
 

　　由于金丝桃苷为黄酮类化合物，本实验采用甲醇和0.2%磷酸溶液的二元流动相体系，但实验中发现拖尾峰(tailingpeak)。前者少见。>色谱峰有拖尾现象。经反复实验发现，在1000ml的0.2%磷酸溶液中加入1.8ml三乙胺时的分离效果*，经多次，多批样品测试，系统具有良好的重复性和稳定性，三乙胺能与ODS柱中键合相的残余硅醇基相互作用，提高分离度，有助于改善峰形。因此以甲醇-0.2%磷酸溶液(46∶54)用三乙胺调pH至3.0为优，分离效果较好，保留时间适中，且无干扰[3]。本方法操作简便、快速、重复性好，适用于地榆中金丝桃苷含量的测定。
 

　　3、样品分析
 

　　对不同产地地榆中的金丝桃苷含量进行了测定，结果表明，不同产地金丝桃苷的含量存在着一定的差异，有必要对其进行质量控制。