饲料中的三聚氰胺检测方法
更新更新时间：2013-04-18
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要：本文采用液相色谱仪对饲料中的三聚氰胺进行检测，建立了饲料中三聚氰胺的液相色谱法，zui小检测浓度达0.01mg/kg，回收率＞80%，峰面积的RSD为0.275% ，有良好的线性关系（r=1.00000），具有快速、准确、等特点。
三聚氰胺，简称三胺，分子式C3N6H6，是一种重要的氮杂环有机化工原料。由于三聚氰胺分子中含有大量氮元素，而普通的全氮测定法测饲料和食品中的蛋白质含量时不能排除这类伪蛋白氮的干扰，因而一些厂商为了能降低成本而添加这种化工原料，以提高产品中蛋白质含量。《化学品安全手册》第三卷和化学品安全卡片说明：长期或反复大量摄入三聚氰胺可能对肾与膀胱产生影响，导致产生结石。奶粉中相继查出含大量的三聚氰胺，不由让我们对饲料中是否含有三聚氰胺，产生质疑。本文采用浙江福立分析仪器有限公司生产的FL2200液相色谱仪建立饲料中三聚氰胺快速、准确的检测方法。
1、 材料和方法
1.1 主要仪器和试剂
液相色谱仪；
高速离心机（10000r/min）；
超声波震荡仪；
涡旋混合器；
分析天平（万分之一）；
溶剂过滤器（带0.45um有机、水系过滤膜和真空泵）；
乙腈（HPLC级）；
三聚氰胺（≥99.0%）；
柠檬酸（分析纯）；
辛烷磺酸钠（色谱级）；
三录乙酸（优级纯）；
乙酸铅（优级纯）；
水（二次蒸馏水以上）；
稀释液:50%甲醇水溶液；
1.2 色谱条件：
色谱柱 Venusil ASB C8 4.6*250mm 5um
流动相 乙腈：10mM/L柠檬酸+10mM/L辛烷磺酸钠缓冲液=10：90（pH=3.0）
检测波长 240nm
柱温 40℃
流速 1ml/min
进样量 20uL
2、实验部分
2.1三聚氰胺标准储备液和标准溶液的配制
准确称取三聚氰胺标样100.0mg ，放于25ml烧杯中，加稀释液20ml超声波溶解1分钟，然后转移到100ml的容量瓶中，用稀释液清洗烧杯5次，每次10ml，然后把清洗后的稀释液全部转移到100ml容量瓶中，用稀释液定容100ml，即得浓度为1000mg/L三聚氰胺标样溶液。
准确量取浓度为1000mg/L三聚氰胺标样溶液50ml，用流动相定容至500ml，即得浓度为100mg/L的三聚氰胺标准溶液。
分别准确量取浓度为100mg/L的三聚氰胺标准溶液0.8ml、2ml、20ml、40ml、80ml、放于100ml的容量瓶中，用流动相定容100ml，得浓度为0.8mg/L、2mg/L、20mg/L、40mg/L、80mg/L的标准溶液，过0.45um的有机过滤头过滤，保存待测。
2.1.1 重复性测定
取浓度为80.0mg/L的标准溶液，重复进样3次，测定结果见表1，色谱图见图1。
2.1.2 线性试验
取浓度为0.8mg/L、2mg/L、20mg/L、40mg/L、80mg/L、50mg/L的标准品分别作样，绘制浓度-峰面积的曲线。实验表明：三聚氰胺在0.8-80.0mg/L间，有良好的线性，见图2。
可得：W=-0.037868+0.000011*A；R2=1.00000
2.1.3 三聚氰胺zui小检测浓度
在上述试验条件下，以3S/N为zui小检测浓度，三聚氰胺的zui小检测浓度为0.01mg/kg
2.2空白实验
称取5.00g纯净水于100ml锥形瓶中，加入50ml三录乙酸溶液（1%）和2ml乙酸铅溶液（22g/L），摇匀，超声提取20min。静置2min，取上层清液30ml，10000r/min离心10min。取上清液10ml做待净化液。
（以下流速控制＜1.00ml/min）
搭好固相萃取装置，接上混合型阳离子交换固相萃取柱，向小柱中加入3ml甲醇，抽至近干，加入3ml水活化，抽至近干，将净化液缓慢转移至固相萃取柱，抽至近干，加3ml水洗涤，抽至近干，加3ml甲醇洗涤，抽至近干，换成收集管，加入6ml氨化甲醇溶液洗脱，把收集的收集液于55℃下氮气吹干，残留物加2ml流动相溶解，涡旋混合2min，超声波2min，0.45um过滤头过滤。
在上述色谱条件下进样，结果未出峰。
2.3 样品前处理与测定
随机抽取市面上的饲料，进行处理分析。
称取5.00g试样于100ml锥形瓶中，加入50ml三录乙酸溶液（1%）和2ml乙酸铅溶液（22g/L），摇匀，超声提取20min。静置2min，取上层清液30ml，10000r/min离心10min。取上清液10ml做待净化液。
（以下流速控制＜1.00ml/min）
搭好固相萃取装置，接上混合型阳离子交换固相萃取柱，向小柱中加入3ml甲醇，抽至近干，加入3ml水活化，抽至近干，将净化液缓慢转移至固相萃取柱，抽至近干，加3ml水洗涤，抽至近干，加3ml甲醇洗涤，抽至近干，换成收集管，加入6ml氨化甲醇溶液洗脱，把收集的收集液于55℃下氮气吹干，残留物加2ml流动相溶解，涡旋混合2min，超声波2min，0.45um过滤头过滤。
2.4 回收率实验
称取5.00g试样于100ml锥形瓶中，分别加入浓度为2mg/L三聚氰胺标准溶液1ml、2ml、3ml；分别加入浓度为20mg/L三聚氰胺标准溶液1ml、2ml、3ml；分别加入浓度为40mg/L三聚氰胺标准溶液1ml、2ml、3ml，然后依次加入49、48、47ml三录乙酸溶液（1%）和2ml乙酸铅溶液（22g/L），摇匀，超声提取20min。静置2min，取上层清液30ml，10000r/min离心10min。取上清液10ml做待净化液。
（以下流速控制＜1.00ml/min）
搭好固相萃取装置，接上混合型阳离子交换固相萃取柱，向小柱中加入3ml甲醇，抽至近干，加入3ml水活化，抽至近干，将净化液缓慢转移至固相萃取柱，抽至近干，加3ml水洗涤，抽至近干，加3ml甲醇洗涤，抽至近干，换成收集管，加入6ml氨化甲醇溶液洗脱，把收集的收集液于55℃下氮气吹干，残留物加2ml流动相溶解，涡旋混合2min，超声波2min，0.45um过滤头过滤。
3、 结论
试验证明：采用液相色谱仪测定饲料中的三聚氰胺，具有检测灵敏度高、精密度高、准确度高、线性范围好和回收率高等优点，*符合分析要求，适合各类饲料中三聚氰胺的快速检。（色谱仪器网）
